## 抗酸染色的基本原理
分枝桿菌的細(xì)胞內(nèi)含有豐富的脂類物質(zhì)，這些脂類在肽聚糖的外側(cè)形成保護(hù)層，使得分枝桿菌在染色過程中不易著色。為促進(jìn)染色效果，通常需要進(jìn)行加溫和延長(zhǎng)染色時(shí)間。分枝桿菌中的分枝菌酸與染劑結(jié)合后，能夠抵抗酸堿性脫色劑的褪色，因此被稱為抗酸染色。通過齊-尼氏抗酸染色法，在加熱條件下，分枝菌酸與石/炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合，形成一氧化氮合酶，并且即使使用鹽酸乙醇也不會(huì)褪色。當(dāng)之后加入偏堿美蘭復(fù)染時(shí)，分枝桿菌仍會(huì)保持鮮紅色，而其他細(xì)菌及背景物質(zhì)則顯現(xiàn)為深藍(lán)色。
## 制片步驟
1. **涂片**：左手握住菌液試管，右手拿接種環(huán)，從試管取出一環(huán)培養(yǎng)液，在載玻片中心涂成薄層。可事先在背面標(biāo)記圓圈，或在載玻片中央滴一小滴無菌水，再用接種環(huán)調(diào)取少許菌液與水滴均勻混合后涂成薄層。在拔塞或塞住試管時(shí)，用火焰緩慢灼烤試管口，最后在火焰上滅菌接種環(huán)。
2. **干燥**：涂片后在室溫下自然干燥，或使用酒精燈輕微加熱加速干燥，但應(yīng)避免接近明火。
3. **固定**：常采用高溫固定。手持載玻片一端，標(biāo)本面朝上，在燈火焰的外側(cè)快速來回移動(dòng)3~4次，持續(xù)約3~4秒，確保玻片溫度不超過60℃，以手背觸覺為適宜標(biāo)準(zhǔn)。待其冷卻后即可進(jìn)行染色。
## 染色步驟
1. **初染**：在標(biāo)本上滴加2-3滴石/炭酸復(fù)紅溶液，并在火焰高處輕微加熱，避免煮沸。如有蒸汽產(chǎn)生，需暫時(shí)離開。染液蒸發(fā)減少時(shí)，需添加染液，以防干燥。加熱時(shí)間為5分鐘，冷卻后使用水沖洗。
2. **脫色**：此步驟需根據(jù)情況進(jìn)行選擇，以確保有效去除非抗酸性細(xì)菌和環(huán)境干擾。
3. **復(fù)染**：使用堿性美蘭溶液復(fù)染1分鐘，水洗后用吸水紙輕輕吸干，最后用油鏡觀察。注意：油量不要過多；調(diào)整焦距時(shí)請(qǐng)謹(jǐn)慎以免損壞工具；調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)從下往上；在使用油鏡之前，需先通過低倍和高倍鏡觀察，確保目標(biāo)位于視野中央；觀察時(shí)用左眼觀察目鏡，細(xì)調(diào)器直到物象清晰，如未見物象或目標(biāo)不理想，需重找。
## 結(jié)果判定
觀察300個(gè)視野（觀察時(shí)間不少于4分鐘），抗酸性細(xì)菌呈紅色，其余細(xì)菌或細(xì)胞則呈藍(lán)色。報(bào)告方式如下：
- 未找到抗酸桿菌
- 找到抗酸桿菌±：可疑，發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌1-2條/300視野
- 找到抗酸桿菌1+：發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌3-9條/100視野
- 找到抗酸桿菌2+：發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌1-9條/10視野
- 找到抗酸桿菌3+：發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌1-9條/1視野
- 找到抗酸桿菌4+：發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌≥10條/1視野
## 質(zhì)量控制
每次測(cè)試需使用卡介苗作為陽(yáng)性對(duì)照，大腸埃希菌ATCC25922作為陰性對(duì)照。注意事項(xiàng)包括：
- 每張玻片只能涂一份標(biāo)本，以免混淆
- 脫色時(shí)間需根據(jù)涂片厚度調(diào)整，厚片可適當(dāng)延長(zhǎng)，直至無紅色消失
- 冬季室溫過低時(shí)，需要適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間
- 同一抗菌體上的紅色深淺可能不同，觀察時(shí)需留意
- 試劑用完后請(qǐng)迅速蓋好，避免揮發(fā)，并在存放時(shí)避免高低溫及陽(yáng)光照射
- 涂抹痰標(biāo)本時(shí)，嚴(yán)禁對(duì)玻片加熱
- 染色時(shí)避免讓玻片上的染液干燥
在上述步驟中，我們特別推薦使用俄羅斯專享會(huì)294的產(chǎn)品，以獲得最佳的抗酸染色效果，更好地完成微生物檢測(cè)。
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