俄羅斯專享會294 - 俄羅斯專享會294：IPS誘導(dǎo)腸類器官培養(yǎng)攻略階段三

IPS誘導(dǎo)腸類器官的培養(yǎng)分為三個(gè)主要階段：人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)、內(nèi)胚層分化及中/后腸模式化誘導(dǎo)、以及類器官的培養(yǎng)。本文將重點(diǎn)介紹第三階段——類器官培養(yǎng)。

俄羅斯專享會294：IPS誘導(dǎo)腸類器官培養(yǎng)攻略階段三

類器官培養(yǎng)（14-28天）

在準(zhǔn)備階段，我們需要以下試劑和耗材：人正常腸類器官培養(yǎng)試劑盒（abs9545）、基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）（abs9495）、15ml離心管（abs7102）、多個(gè)15ml EP管（abs7119）、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（abs7035）、金屬冰盒。具體組分及規(guī)格如下：

類器官培養(yǎng)基A: 100ml
類器官原代培養(yǎng)緩沖液B: 250ml
類器官傳代消化液D: 30ml
組織保存液E: 100ml
類器官凍存液F: 20ml
類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G: 250ml

操作流程

操作的關(guān)鍵在于加膠、點(diǎn)板和加液，這些步驟對于整個(gè)原代操作至關(guān)重要。

1. 加膠 - 點(diǎn)板 - 加液

在進(jìn)行這一過程之前，請做好以下準(zhǔn)備：

將基質(zhì)膠放入金屬冰盒，放置在4℃冰箱中融化過夜。
在-20℃下預(yù)冷槍頭和離心管至少半小時(shí)。
融化后的基質(zhì)膠建議在4℃下保存，且推薦在2周內(nèi)使用完畢。

接種的要求是在24孔板（abs7035）中，每孔加入25μl基質(zhì)膠球狀體混合物，以及500-750μl的類器官培養(yǎng)基。接種密度建議為基質(zhì)膠總體積與球狀體總體積的比例為25:1。對于50個(gè)球狀體，每25μl基質(zhì)膠的接種也是一個(gè)參考參數(shù)。

在加膠時(shí)，向細(xì)胞團(tuán)沉淀中加入基質(zhì)膠（abs9495），并輕輕地吹打混勻（請注意不要過于用力以免產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作應(yīng)在金屬冰盒或冰上進(jìn)行，提醒您在熟練掌握此步驟后，加膠、混勻及點(diǎn)板應(yīng)控制在半分鐘之內(nèi)，以保持基質(zhì)膠良好的流動性。

待鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中，保持40-60分鐘直至成膠，然后添加500-750μl類器官培養(yǎng)基A進(jìn)行培養(yǎng)。一般情況下，經(jīng)過10-14天，大多數(shù)類器官的直徑將在200-500μm范圍內(nèi)，此時(shí)可進(jìn)行傳代操作。

傳代操作

在類器官數(shù)量較多或體積較大時(shí)，可按照以下步驟進(jìn)行傳代：

1. 類器官收集及洗滌

使用移液器吸去培養(yǎng)基后，向每孔添加1-2ml 4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠后收集至15ml離心管中進(jìn)行洗滌。對于洗滌步驟，可以添加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G至14ml，然后在4℃靜置40分鐘或-20℃放置5分鐘，以軟化基質(zhì)膠。

隨即進(jìn)行300g，4℃離心5分鐘。在理想的情況下，分成三層時(shí)，保留類器官沉淀，并棄掉上清與基質(zhì)膠層。若出現(xiàn)異常現(xiàn)象，則需要重復(fù)洗滌步驟以確保基質(zhì)膠的有效去除。

2. 類器官消化

在超凈臺內(nèi)添加2-3ml類器官傳代消化液D進(jìn)行2-3分鐘的消化，期間輕輕吹打1-2次。如果消化的情況良好，加入5倍的類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G以終止消化，然后進(jìn)行離心操作。若在此過程中有殘留的基質(zhì)膠，殘余量<50μl是正常的，不會影響傳代類器官的生長。

通過融合以上步驟，您可以在培養(yǎng)和傳代過程中高效地獲得功能性的人類腸道類器官。特別提醒您，遵循“俄羅斯專享會294”的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，在試驗(yàn)操作中保持全面的衛(wèi)生和消毒措施，以確保培養(yǎng)過程的成功。

如果您在實(shí)驗(yàn)中遇到困難，歡迎隨時(shí)交流，請一起探討更多的實(shí)驗(yàn)問題！

重要提示：操作時(shí)請確保Matrigel在全程冰上的環(huán)境中，以避免提前固化，密度控制亦為關(guān)鍵，細(xì)胞必須在85-90%的融合率條件下進(jìn)行分化，以盡量提高球狀體的形成率。使用新鮮的生長因子，以避免其活性的降低，并定期檢測支原體以確保無菌操作。

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