流式細胞術（Flow Cytometry）是一種結合了細胞生物學、免疫學和流體力學等多個學科的生物學技術，廣泛應用于生物醫學領域，如免疫學、血液學和腫瘤學等研究。在進行流式細胞實驗時，必須嚴格遵循操作規程，以確保實驗結果的準確性。本期我們將從樣本處理、實驗設計、抗體染色及儀器檢測四個關鍵方面，探討流式實驗中的注意事項。
1. 樣本處理
在流式細胞術中，需收集足夠數量且具有完整活性的細胞樣本。根據不同類型樣本，可采用適宜的方法制備單細胞懸液。
① 單細胞懸液制備：
外周血樣本：一般在采血后使用肝素進行抗凝處理，并分離紅細胞。對于需要后續刺激培養的細胞，建議采用Ficoll分離法。
實體組織樣本：使用機械研磨或酶解法處理以形成單細胞懸液。
② 細胞樣本收集：
凍存細胞在冷凍和解凍過程中會產生應激反應，因此推薦在培養或傳代后，待細胞的表型和生物功能恢復后再進行檢測。在收集和清洗細胞樣本時，需控制離心機離心力不超過300×g，避免使用過快的升速和降速。樣本制備完成后，應在染色前統計細胞數量并調整懸液密度，確保實驗組之間的一致性。
2. 實驗設計
在選擇實驗指標時，應優先選用表達量高的指標，且考慮選擇位于細胞膜外的表面蛋白作為檢測目標，以簡化實驗流程。如需對分選后的細胞進行后續培養，必須標記其表面指標。
熒光素選擇：推薦選擇熒光亮度高且發射波峰差距大的熒光素，以減少信號間的相互干擾。在指標與熒光素搭配時，必須遵循流式配色的關鍵原則。
此外，合理設置對照組有助于提高分析結果的準確性。常用對照包括單染對照、同型對照、熒光減一（FMO）對照等。對照設置的方法可參考以往的流式課堂。
3. 抗體染色
抗體染色是實現抗體識別目標蛋白，并將流式抗體上的熒光素特異性標記到目標細胞的過程。在使用抗體時，應盡量避免重復凍融。
以下是抗體染色過程中可能出現的一些情況：
① 抗體用量問題：用量過多可能導致背景信號增強，反之則染色結果不明顯?？赏ㄟ^抗體滴定實驗調整抗體用量至適宜范圍。
② 固定/破膜時的染色：對于需要同時檢測細胞表面和胞內抗原的實驗，建議在固定/破膜前進行細胞表面抗原的染色。
③ 死細胞染色：死細胞常會產生自發熒光或非特異性吸附熒光抗體，導致假陽性。建議使用適當的生死染料對死細胞進行染色。
④ 熒光猝滅：熒光素在強光照射下易發生猝滅，因此抗體的儲存與孵育需在避光條件下進行。
4. 儀器檢測
在上機前，需對流式細胞儀進行清洗，避免儀器中殘留熒光染料，并使用200目左右的尼龍篩網過濾樣本，以去除樣本中的團塊。
細胞染色完成后，應盡快進行檢測，以免長時間放置或不當保存導致熒光素亮度降低。
上機時應根據陰性對照的信號調整各檢測通道的電壓，以確保樣本信號完整顯示，并保持實驗中的電壓不變。同時，需設定合適的信號收集閾值，以提高信號采集效率。
為確保獲得可進行統計分析的有效數據，通常有效細胞信號需在15000-20000以上，而多層次圈門中比例極小的細胞群，建議目標細胞群數量不少于500。
結束采集后，應及時清洗儀器，避免熒光染料殘留或細菌生長。
以上是俄羅斯專享會294總結的流式實驗注意事項，祝大家能夠獲得優異的實驗結果！如有更多流式實驗經驗和心得，歡迎與我們溝通交流。有關流式實驗的精彩內容，請繼續關注俄羅斯專享會294。
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